【48812】用高效液相色谱法测定乳制品中的三聚氰胺

  三聚氰胺（化学式：C3H6N6）呈弱碱性，能溶于甲醛、乙酸等，微溶于水和醇，不行用于食物加工或食物添加物。三聚氰胺可用来出产食物包装资料、农药和化肥，可能从环境、食物包装资料等途径进入到食物中，在产品中检出微量归于正常。三聚氰胺的含氮量为66％左右，常被不法商人添加到食物中，以提高检测中蛋白质的含量方针。

  试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交流固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

   仪器高效液相色谱仪LC-20AD、电子剖析天平（感量为0.0001g）、电子天平（感量为0.01g）、离心机、超声波清洗器、旋涡混合器、固相萃取设备、氮吹仪、线mL具塞塑料离心管等。

   试剂与资料实验用水均为重蒸水；甲醇、乙腈（色谱纯）；氨水、柠檬酸（剖析纯）；辛烷磺酸钠：纯度大于98.0%；50％甲醇水溶液；1％三氯乙酸溶液；5％氨化甲醇溶液；离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，参加约980 mL 水溶解，调理pH 至3.0 后，定容至1L备用；三聚氰胺规范品：纯度大于99.0%；1mg/mL的三聚氰胺规范储藏液（用1+1甲醇-水溶液溶解定容）；阳离子交流固相萃取柱：临用前顺次用3 mL甲醇和5 mL水活化；微孔滤膜：0.2μm，有机相；氮气：纯度大于99.999%等。

   1．规范曲线; 用活动相将三聚氰胺规范储藏液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80 μg/mL 的规范工作液，以峰面积-浓度作图，得到规范曲线; 提取 称取2 g（准确至0.01 g）试样于50mL具塞塑料离心管中，参加15 mL1%三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超声提取10 min，再振动提取10 min后，以11000r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液潮湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，参加5mL水混匀后做待净化液。

   净化 将上一进程中的待净化液转移至固相萃取柱（临用前现已活化）中。顺次用3mL水和3 mL甲醇洗刷，抽至近干后，用6 mL5%的氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取进程流速不超越1mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 mL活动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

  待测样液中三聚氰胺的响应值应在规范曲线线性规模内，超越线性规模则应稀释后再进样剖析。

  2．精密度的实验。在不含三聚氰胺的奶样平分别参加浓度为１.０，１０.０，２０.０μg/mL的三聚氰胺规范溶液，每种浓度接连测定11次，测得成果的相对规范偏差分别为3.2%、1.8%、1.5%。

   3．加标回收率实验。在含三聚氰胺3.31%的奶样平分别参加浓度为2.0和10.0μg/mL的三聚氰胺规范溶液，测得加标后的样品浓度和为5.14和１3.08 μg/mL,三聚氰胺回收率为91.5%和97.7%。

  1．离子对试剂缓冲液挑选。离子对试剂挑选庚烷磺酸钠要优于辛烷磺酸钠。一般来说，碳链短的比碳链长的别离度要好，并且碳链越长，离子对试剂和柱子的平衡时刻越长，柱子越不易冲刷，对柱子危害越大。

  2．离子对试剂缓冲液pH值的挑选。C8柱、C18柱运用的缓冲液pH值规模在2～7.5之间，太高的pH值，会使色谱柱硅胶溶解，太低的pH值，会使色谱柱键合的烷基掉落。所以离子对试剂缓冲液pH值挑选3.0。

  3．活动相份额的挑选。活动相（离子对试剂缓冲液和乙腈）的份额应依据仪器和挑选的色谱柱作相应的调整，以到达最好的色谱别离。原则是尽量延伸三聚氰胺的出峰时刻，以便更好地别离杂质和方针物。乙腈含量一般操控在10%-20%，乙腈份额越大，出峰时刻越快。通过屡次实验，色谱柱用C18三聚氰胺专用柱，乙腈含量15%时，三聚氰胺规范出峰时刻在8.5min左右；乙腈含量13%时，三聚氰胺规范出峰时刻在10.3 min左右；乙腈含量10%时，三聚氰胺规范出峰时刻在15.6min左右。乙腈含量10%，样品别离作用好。

  ②固相萃取柱在临净化前，一定要先活化，过柱时不能等流干之后再加溶剂，避免气泡进入，影响净化和萃取作用；操控整个萃取进程流速安稳且不答应超出1mL/min（一般操控在25滴/分），不然影响去除杂质和洗脱三聚氰胺的作用。

  ③仪器的平衡：由于活动相中添加了一定量的离子对试剂，大约需求3h～5h仪器才能够做到安稳的状况。

   ④别离：原则是尽量延伸三聚氰胺的出峰时刻，以便更好地别离杂质和方针物。

  ⑤样品剖析时刻：依据不同样品设定剖析时刻，由于有很大的可能性上一针所进样品的杂质会在下一针出峰，并且保存时刻会和三聚氰胺的出峰时刻堆叠，易发生误判。例如用三聚氰胺专用柱，活动相份额为9010的情况下，三聚氰胺出峰时刻在15 min左右，而在35 min左右还要出一个杂峰（在样品除脂不完全时）。

  ⑥当检出阳性样品的峰不规则时，应仔细判别是否是杂峰或是与杂峰堆叠。办法是从样品瓶中转移出一部分样液，加标后再进针判别，或与有质谱的实验室做比对。

   （作者单位：河北省藁城市质量技术监督局）